Một số kĩ thuật trong sinh học phân tử

Tách chiết DNA/RNA là một quá trình vật lý và hóa học được sử dụng để tinh lọc DNA/RNA từ một mẫu

Có 3 bước chính trong quy trinh tách chiết DNA/RNA

Bước 1: Phá màng tế bào, màng nhân

Bước 2: Loại protein

Bước 3: Tủa nucleic acid và thu mẫu

Phá bỏ màng tế bào, màng nhân để giải phóng DNA/RNA đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng.

Các hóa chất trong chất tẩy có hoạt động bề mặt mạnh, sẽ giúp phá vỡ màng tế bào và màng nhân.

Vì Ethanol hoặc Isopropanol là có ái lực với nước mạnh hơn DNA/RNA, do đó nó phá vỡ mối tương tác giữa nước và nucleic và DNA/RNA sẽ kết tủa lại

Sử dụng Ethanol hoặc Isopropanol để tủa DNA trong dung dịch.

Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn.

Để thực hiện loại bỏ protein người ta chủ yếu sử dụng hỗ hợp Phenol/Chloroform. Phenol-Chloroform không tan trong nước nhưng có khả năng làm biến tính protein. Do đó, protein sẽ bị tủa lại khi gặp phenol. Trong khi đó DNA thì không bị tủa bởi phenol nên vẫn tan trong nước.

Sau khi tủa DNA/RNA, người ta sẽ mang mẫu đi ly tâm để tinh sạch DNA/RNA sau đó thu cặn DNA/RNA

Tùy theo kích thước của phân tử ADN mà người ta dùng các loại gel khác nhau:

- Phân tử ADN có dưới 500 đôi Nu Dùng polyacrylamid gel

- Phân tử ADN có dưới 500 - 10.000 Nu Dùng Agarose gel

- Phân tử ADN có nhiều đôi Nu hơn Dùng Agarose gel có lỗ to hơn (Pulsed field agarose gel).

Để quan sát hình ảnh ADN khi điện di, người ta nhuộm ADN bằng ethidium bromide, dưới ánh sáng tử ngoại, ADN gắn với ethidium bromide sẽ phát sáng.

Điện di agarose gel được sử dụng trong các trường hợp sau:

- Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…).

- Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…).

- Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi

- Kiểm tra kết quả tách chiết ADN.

Ưu điểm của phương pháp điện di agarose gel là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu, và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi.

Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.

Các đoạn ADN tích điện âm nhờ khung phosphate của nó và vì thế khi được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển từ cực âm đến cực dương.  

Các phân tử ADN khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm sang cực dương với tốc độ di chuyển khác nhau. Phân đoạn ADN có kích thước càng nhỏ thì có tốc độ di chuyển càng nhanh và ngược lại.

Vì vậy, chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di, qua đó người ta có thể thu thập và phân tích được từng phân đoạn ADN hoặc gen riêng rẽ.

Các phân tử âm hay dương trong một điện trường sẽ di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của:

+ Lực điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau)

+ Kích thước của phân tử so với kích thước của lỗ gel

+ Hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử

Sản phẩm PCR là đoạn có kích thước dài 550 + 25x2 = 600 cặp bazơ (bp).  Hai alen A và G sẽ có 3 kiểu gen khác nhau là AA, GG và AG.

+ Kiểu gen AA: Alen A có 2 vị trí nhận biết của một enzim giới hạn (RE) tại các vị trí nuclêôtit 136 và 240 trong vùng mã hóA. Dó đó, sau khi cắt sẽ thu được 3 đoạn ADN, vì vậy khi thực hiện điện di trên gel agarôzơ sẽ quan sát được 3 băng có vị trí lần lượt từ thấp đến cao tương ứng với các kích thước là:

Băng 1 có 335 cặp bazơ (310+25 = 335);

Băng 2 có 161 cặp bazơ (136+25 = 161)

Băng 3 có 104 cặp bazơ

+ Kiểu gen GG: Alen G chỉ có 1 vị trí nhận biết của một enzim giới hạn (RE) tại vị trí nuclêôtit 240 trong vùng mã hóA. Dó đó, sau khi cắt sẽ thu được 2 đoạn ADN nên sau khi thực hiện điện di trên gel agarôzơ chỉ quan sát được 2 băng có vị trí lần lượt từ thấp đến cao tương ứng với các kích thước là:

Băng 1 có 335 cặp  bazơ (310+25 = 335)

Băng 2 có 265 cặp bazơ (240+25 = 265)  

+ Kiểu gen AG: Do kiểu gen AG chứa hỗn hợp các đoạn gen A và gen G nên sau khi thực hiện điện di thu được 4 băng có kích thước lần lượt là:

Băng 1 có 335 cặp bazơ (310+25 = 335);

Băng 2 có 265 cặp bazơ;

Băng 3 có 161 cặp bazơ (136+25 = 161)

Băng 4 có 104 cặp bazơ.

Hình điện di vị trí các băng (các làn AA, AG, GG)

Theo kết quả điện di ở hình 21A: Người đàn ông “PF1” không thể là cha của đứa bé “CH” vì kết quả xét nghiệm một loại STR đã cho thấy “CH” chỉ có một vạch trùng với mẹ “MO” và không có vạch trùng với “PF1”.

Trong hình 21B, kết quả cho thấy “CH” có một vạch trùng với mẹ “MO” và lại có một vạch trùng với người đàn ông “PF2”. Do đó, PF2 có thể là cha ruột đứa bé “CH”.

Hội chứng patau là một hội chứng bất thường ở nhiễm sắc thể khi bình thường em bé sinh ra với 46 nhiễm sắc thể, xếp thành 23 cặp nhưng nếu bị hội chứng patau, bé sẽ có thêm một bản sao của nhiễm sắc thể thứ 13 (trisomy 13) trong mỗi tế bào của cơ thể.

Người III1 mắc hội trứng Patau.

Giải thích: khi quan sát kết quả điện di trên hình 22C lôcut Z ở NST thứ 13 của người này có 3 alen K, L, M chứng tỏ rằng người III1 có chứa 3 NST 13 => hội chứng patau

Mục đích: phát hiện và nhân đoạn ADN nhiều lần trong ống nghiệm.

Để thực hiện được phương pháp cần có:

+ Phân tử ADN ban đầu,

+ Hai đoạn ADN mồi (primers) ( mỗi mồi gồm khoảng 20 base, hai mồi này gắn ở hai đầu của phân tử ADN ban đầu: mồi ngược và mồi xuôi).

+ 4 loại Nu (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).

+ Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt độ cao; enzym này được tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus.