I. Tách chiết DNA/RNA
Tách chiết DNA/RNA là một quá trình vật lý và hóa học được sử dụng để tinh lọc DNA/RNA từ một mẫu
Đây là kỹ thuật cơ bản trong phần đông các phòng thể nghiệm phân tử, di truyền và sinh vật học nói chung.
Cho đến nay đã có rất nhiều quy trình tách chiết DNA được đưa ra và báo cáo thành công bởi nhiều nhà nghiên cứu. Đối với mỗi loại mô, tế bào quy trình tách chiết có thể sẽ khác nhau. Dù vậy thì nguyên lý tách chiết ADN từ tế bào vẫn gồm các bước cơ bản sau:
Bước 1: Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô trong dung dịch chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng.
Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn.
Bước 2: Loại protein
Sau khi phá vỡ tế bào, DNA sẽ được trộn lẫn với các thành phần khác của tế bào, chủ yếu là protein trong dung dịch. Việc quan trọng lúc này là tách DNA ra khỏi thành phần protein của tế bào.
Để thực hiện bước này người ta chủ yếu sử dụng hỗ hợp Phenol/Chloroform. Phenol-Chloroform không tan trong nước nhưng có khả năng làm biến tính protein. Do đó, protein sẽ bị tủa lại khi gặp phenol. Trong khi đó DNA thì không bị tủa bởi phenol nên vẫn tan trong nước.
Khi ly tâm phenol/Chloroform nặng sẽ lắng xuống dưới, protein tủa sẽ nằm tại danh giới của nước và phenol, còn DNA thì nằm lại trong pha nước ở phía trên. Thu pha nước chứa DNA này để thực hiện các bước tiếp theo.
Bước 3: Tủa nucleic acid
Sau bước tủa protein, DNA thu được nằm trong dung dịch với dung môi là nước.
Sử dụng Ethanol hoặc Isopropanol để tủa DNA trong dung dịch.
Sau đó ly tâm để thu cặn DNA.
Cặn DNA này có thể được rửa trong Ethanol 70% một hoặc hai lần để làm sạch mẫu.
Tiếp theo để cho bay hơi cồn và huyền dịch hóa cặn DNA thu được trong đệm.
Hình 1. Quy trình tách chiết DNA cơ bản
II. Điện di
Điện di thường được dùng trong việc tinh sạch và phân tích các phân tử sinh học như nucleic acid, protein và một số ít phức hợp của carbohydrat, lipid.
Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.
Tùy theo kích thước của phân tử ADN mà người ta dùng các loại gel khác nhau:
- Phân tử ADN có dưới 500 đôi Nu Dùng polyacrylamid gel
- Phân tử ADN có dưới 500 - 10.000 Nu Dùng Agarose gel
- Phân tử ADN có nhiều đôi Nu hơn Dùng Agarose gel có lỗ to hơn (Pulsed field agarose gel).
Để quan sát hình ảnh ADN khi điện di, người ta nhuộm ADN bằng ethidium bromide, dưới ánh sáng tử ngoại, ADN gắn với ethidium bromide sẽ phát sáng.
Khi cho chạy điện di ADN nghiên cứu thường có ADN mẫu (Marker) cùng chạy để so sánh, xác định số lượng Nu của đoạn ADN.
Phương pháp điện di ADN còn được dùng để kiểm tra kết quả tách chiết ADN.
Điện di trên agarose gel
Hình 2. Cấu trúc phân tử agarose
Điện di agarose gel được sử dụng trong các trường hợp sau:
- Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…).
- Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…).
- Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi
thẩm tích Northern.
Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu, và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi.
Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.
Hình 3. Sơ đồ minh họa các bước điện di trên agarose gel
Hình 5. Hình ảnh điện di DNA chạy trên agarose gel 1%.
Các băng DNA có màu sáng. SM: Chuẩn kích thước của DNA (1 kb ladder). Các đường 1, 2 và 3: mẫu plasmid DNA được cắt bằng 3 enzyme hạn chế khác nhau.
III. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
Mục đích phương pháp: phát hiện và nhân đoạn ADN nhiều lần trong ống nghiệm.
Để thực hiện được phương pháp cần có:
+ Phân tử ADN ban đầu,
+ Hai đoạn ADN mồi (primers) ( mỗi mồi gồm khoảng 20 base, hai mồi này gắn ở hai đầu của phân tử ADN ban đầu: mồi ngược và mồi xuôi).
+ 4 loại Nu (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
+ Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt độ cao; enzym này được tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus.
Phương pháp PCR thực hiện qua nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: ủ ADN ban đầu ở nhiệt độ cao: 92 - 950C để tách ADN thành sợi đơn.
- Giai đoạn lai ghép: ADN mồi được lai ghép với sợi đơn của ADN ban đầu. Thực hiện ở nhiệt độ: 50 - 520C.
- Giai đoạn tổng hợp ADN: Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếp các Nu vào sau ADN mồi dựa ADN ban đầu làm khuôn. Thực hiện ở nhiệt độ: 70 - 720C. Sau mỗi chu kỳ, từ một phân tử ADN ban đầu tổng hợp nên hai phân tử ADN, đến chu kỳ sau hai phân tử này lại làm khuôn để tổng hợp nên 4 phân tử ADN.
Qua các giai đoạn như đã nêu ở trên, và cứ như vậy thực hiện tiếp các chu kỳ sau. Sau 30 chu kỳ từ một phân tử ADN ban đầu sẽ có 230 phân tử được tạo thành
Hình 5. Các giai đoạn trong quá trình PCR
Hình 6. Sơ đồ minh họa một chu kì PCR
